Taninski ekstrakti kot funkcionalni prehranski in krmni dodatki z visokim antioksidativnim, antimikrobnim in antikarcinogenim potencialom
(Tannin extracts as a functional food and feed aditives with high antioxidative, antimicrobial, and anticarcinogenic potential)
Vodja projekta: dr. Gregor Hostnik
1. Osnovni podatki o raziskovalnem projektu
Šifra operacije |
OP20.01252 |
Naslov projekta |
Taninski ekstrakti kot funkcionalni prehranski in krmni dodatki z visokim antioksidativnim, antimikrobnim in antikarcinogenim potencialom |
Vodja projekta |
34351 Gregor Hostnik |
Vrsta operacije |
Raziskovalci na začetku kariere 2.0 |
Obdobje financiranja projekta |
1. 6. 2017 - 31. 5. 2020 |
Programska skupina, v kateri je raziskovalec zaposlen organizacija |
Separacijski procesi in produktna tehnika, prof.dr. Željko Knez, P2-0046, 794 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo |
Gospodarski subjekt, ki sodeluje v raziskovalnem projektu: |
Tanin Sevnica kemična industrija d. d. |
2. Vsebinski opis projekta
Tanini predstavljajo družino naravnih spojin srednje do visoke molske mase, ki so sestavljene iz polifenolov združenih v oligomerne oziroma polimerne molekule. Alternativno slovensko poimenovanje zanje je čreslovina. Tanini kot polimeri fenolnih spojin vsebujejo veliko število hidroksilnih skupin, ki močno interagirajo z ogljikovimi hidrati in proteini, jih zvijajo ter z njimi tvorijo nevodotopne komplekse. Prav posledična uporaba taninov pri strojenju usnja pa je družini naravnih spojin dala tudi njeno ime. Ker čreslovina povzroča tudi obarjanje proteinov iz sline, je navadno grenkega in trpkega okusa z značilnim krčilnim oziroma adstringentnim delovanjem na celice ustne sluznice. Tanine najdemo v celotnem kraljestvu rastlin - najpogosteje se nahajajo v njihovih listih, popkih, semenih, steblih ter koreninah. Običajno ne sodelujejo pri metabolizmu same rastline, ampak se aktivirajo zgolj ob poškodbi celice ali v primeru celične smrti, pomagali pa naj bi tudi regulirati rastlinsko rast. Tanine v telo najpogosteje vnesemo preko uživanja čaja, vina, granatnih jabolk, kakijev, jagodičja, sadnih sokov citrusov, piva, prekajenega mesa, stročnic, čokolade in začimb (nageljnovih žbic, pehtrana, kumine, timijana, vanilije ter cimeta). V Sloveniji pa se z industrijskim pridobivanjem čreslovine z ekstrakcijo hrastovega in kostanjevega lesa ukvarja podjetje Tanin Sevnica d.d.
Tanini se kemijsko delijo na dve veliki skupini: na hidrolizirajoče ter na kondenzirane tanine. Prvi so estri sestavljeni iz centralne molekule monosaharida (ponavadi D-glukoze) ter različnega števila molekul fenolnih kislin. V primeru estrov galne kisline govorimo o galotaninih s tipičnim predstavnikom teogalinom iz čaja,v primeru estrov heksahidroksidifenske kisline ali njene oksidirane oblike dehidroheksahidroksidifenske kisline pa o elagitaninih s tipičnim predstavnikom punicalaginom iz granatnih jabolk. Kot pove že samo ime, se da hidrolizirajoče tanine dokaj enostavno hidrolizirati na osnovne gradnike že z dvigom temperature oziroma z dodatkom kisline, baze ali ustreznih encimov. Kondenzirani tanini pa so oligo- oziroma polimeri flavan-3-olov ter flavan-3,4-diolov povezanih s kemijsko stabilno interflavansko C-C vezjo. Imenujemo jih tudi proantocianidi, saj s pomočjo kislinsko katalizirane oksidacije v vročem alkoholnem mediju razpadajo na antocianidine. Hidrolizirajoči tanini in pa večina kondeziranih taninov je topnih v vodi, zgolj nekateri veliki kondenzirani tanini so nevodotopni. Posledično ekstrakcija taninov običajno poteka z uporabo vode pri visoki temperaturi (hidrosolubilizacija) ali pa s polarnimi organskimi topili. Karakterizacija dobljenih ekstraktov pa zavoljo prisotnosti komplekne mešanice taninov ter zaradi njihove različne topnosti za tehnologe predstavlja velik izziv.
Študija taninov je po svoji zasnovi tako eksperimentalna, kot tudi teoretična. Osredotoča pa se na 5 sklopov izolacije in lastnosti taninov:
DP1 in DP2. Moderne tehnike za ekstrakcijo taninov ter Kemijska karakterizacija taninskih ekstraktov
Preverili smo možnost uporabe ekstrakcije s superkritičnim CO2 za ekstrakcijo taninov. Ekstrakcija s samim CO2 ni omogočala visokih izkoritkov reakcije, medtem ko je dodatek organskih sotopil in vode omogočal višje izkoristke. Ekstrakcija s superkritičnim CO2 s sotopili sicer kaže potencial predvsem na področju specifičnosti ekstrakcije (dobljeni ekstrakti imajo manj kompleksno sestavo).
Iz vodnega ekstrakta kostanjevega lesa smo z uporabo hitre kromatografije na stacionarni fazi Sephadex LH-20 in tekočinske kromatografije na reverzni fazi (stacionarna faza C-18) izolirali dve čisti spojini: veskalagin in kastalagin. Potek izolacije in čistost frakcij smo spremljali s tankoplastno kromatografij in tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, istovetnost končnih produktov pa smo preverili tudi z tekočinsko kromatografijo visoke ločljivostjo sklopljeno z visokoločljivostnim masnim detektorjem. Tako pripralvjeni čisti spojini (čistost > 97 %) smo uporabili v nadalnjih študijah protimikrobnih in antikarcinogenih lastnosti.
DP3. Določanje antioksidativnega potenciala taninskih ekstraktov
Poleg določitve antioksidativnega potenciala z DPPH, smo določili tudi stabilnost galne in elagične kisline v raztopinah z različnim pH-jem. Eksperimentalno študijo smo kombinirali z rezulati kvantnomehanskih izračunov. S kombinacijo obeh metod smo lahko določili, katerim prehodom ustrezajo posamezni vrhovi v spektru. V spektru galne kisline se pri visokih vrednostih pH-ja pojavijo vrhovi, ki so posledica oksidacije galne kisline. S kombiniranjem kvantnomehanskih izračunov in eksperimentalnih spektrov smo lahko določili tudi najverjetnejše strukture oksidacijskih produktov.
DP4. Določanje antimikrobnega potenciala taninskih ekstraktov
Določili smo vrednosti minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) večih surovih ekstraktov, kot tudi čistih spojin (veskalagin, kastalagin, galna kislina). Vse proučevane spojine so zavirale rast bakterij. Najnižji MIC je imela taninska kislina, galna kislina pa najvišjega. MIC veskalagina in kastalagina sta približno enaka in po velikosti nekje med MIC galne in taninske kisline. Pokazali smo tudi, da vrednost MIC narašča približno linearno s koncentracijo gojišča, kar kaže na to, da imajo pomembno vlogo v protibakterijskem delovanju taninov nespecifične interakcije taninov z gojiščem.
Ker naj bila v protimikrobnem delovanju ključna njihova zmožnost da tvorijo koordinacijske spojine z železovimi ioni, smo izmerili konstanto ravnotežje za tvorbo koordinacijskih spojin galne kisline in Fe(II) ione, ter odvisnost le-te od pH. Na podlagi dobljenih rezultatov smo določili še odvisnost model vezave in določili, da je zvrst, ki najverjetneje reagira, dvakrat nabita zvrst galne kisline. Raziskvo smo v nadaljevanju razširili še na elagično kislino, veskalagin in kastalagin, vendar so vse tri raziskave trenutno še v preliminarni fazi.
DP5. Določanje antikarcinogenega potenciala taninskih ekstraktov
Z metodami kvantne mehanike smo določili aktivacijske bariere za reakcijo osnovnih gradnikov taninov s 20-imi kemijskimi karcinogeni z laktonskim obročem. Izkazalo se je, da vsi proučevani osnovni gradniki (galna kislina, elagična kislina, (-)-epicatechic) lahko reagirajo z laktonskim obročem kemijskih karcinogenov. Reaktivnost osnovnih gradnikov je seveda odvisna od stopnje deprotonacije spojine, kot tudi od mesta, na katerem poteče reakcija. Po primerjavi z reaktivnostjo gvanina smo pokazali, da predstavljajo vsi trije proučevani osnovni gradniki taninov razmeroma dobre lovilce kemijskih karcinogenov. Seveda pa je od študij in silico še dolga pot do rezultatov in vivo, saj študije in silico običajno ne upoštevajo kompleksinih pojavov v živih organizmih - npr. farmakokinetike. Rezultate naših opažanj smo objavili tudi v znansetvenem članku: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jnatprod.9b00435