Potencialne nove učinkovine kot rezultat izkoriščanja znanih naravnih polifenolov s številnimi ugodnimi zdravstvenimi učinki

Exploiting Known Natural Polyphenols as Potential New Therapeutics with Multiple Beneficial Health Effects

Vodja projekta: dr. Jelena Tošović

Osnovni podatki o raziskovalnem projektu

Šifra projekta	Z4-2654
Vrsta operacije	Temeljni podoktorski projekt
Obdobje financiranja projekta	9. 2020 - 8. 2022
Nosilna raziskovalana organizacija	Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru
Raziskovalno področje po šifrantu ARRS	Biotehnika/rastlinska produkcija in predelava/Fitomedicina

Vsebinski opis projekta

Potreba po novih zdravilih proti dobro znanim in novim boleznim je nenehno prisotna zaradi sposobnosti patogenov, da se prilagodijo ali najdejo nove načine delovanja. Polifenoli zaradi pogostosti pojavljanja v prehrani ljudi in zaradi njihovih impresivnih bioloških funkcij (ugodni vplivi na zdravje ljudi) nudijo odlične izhodne spojine za razvoj novih zdravil. Poleg ostalih aktivnosti imajo polifenoli obetavno antioksidativno, antikancerogeno in antimikrobno delovanje. To dejstvo je izjemnega pomena za predlagani raziskovalni projekt, saj se bo le-ta osredotočil na preučevanje možnih novih zdravil proti raku in boleznim, ki so povezane z oksidativnim stresom, ter na načrtovanje alternativnih profilaktičnih snovi. Predlagani raziskovalni projekt bo prvič uporabil najsodobnejše računalniške in eksperimentalne tehnike, s katerimi bomo komplementarno raziskovali antioksidativne, antikarcinogene in antimikrobne aktivnosti treh različnih razredov polifenolov. Za identifikacijo polifenolov z največjim antioksidativnim potencialom bo uporabljena kombinacija spektrofotometričnega in elektrokemijskega metodološkega pristopa. Eksperimentalni rezultati bodo dopolnjeni z računalniško raziskavo antioksidativnih mehanizmov na podlagi kvantne mehanike. V ta namen bodo preučene reakcije med polifenoli in fiziološkimi prostimi radikali po nedavno razviti metodologiji QM-ORSA, ki temelji na premišljenem modelu z upoštevanjem termodinamike in kinetike vseh možnih mehanizmov in reakcijskih mest. Za določitev najmočnejših antikarcinogenih spojin med preiskovanimi polifenoli bo izvedena gelska elektroforeza posameznih celic (test komet). Za boljši vpogled v mehanizme antikarcinogene aktivnosti preiskovanih polifenolov bo uporabljenih tudi več računalniških metod. Za prepoznavanje polifenolov, ki zavirajo proteinske tarče (vključene v onkogene signalne kaskade), bo uporabljena nova in napredna računalniška metoda inverznega molekulskega sidranja. Poleg tega bomo z uporabo simulacij molekulske dinamike v povezavi z izračuni proste energije dobili vpogled v molekularne mehanizme in relativno jakost antikarcinogene aktivnosti preučevanih polifenolov. Dodatni cilj predlaganega raziskovalnega projekta je oblikovanje standardizirane metodologije za raziskovanje antikarcinogene aktivnosti, kvantno-mehanskega testa za celotno antikarcinogeno aktivnost (QMOCA), ki se bo osredotočil na kinetično raziskovanje reakcij, pri katerih polifenoli delujejo kot lovilci znanih kemičnih karcinogenov. Z razvojem standardiziranega testa za celotno antikarcinogeno delovanje bomo primerjali vse preiskovane polifenole in razkrili najmočnejše lovilce kemičnih karcinogenov. Zaradi povečane problematike bakterijske odpornosti na antibiotike bomo identificirali nove naravne spojine z visokim antimikrobnim potencialom in določili njihove minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) in minimalne baktericidne koncentracije (MBC). Molekularne mehanizme antimikrobne aktivnosti bomo preučili tudi z metodo inverznega molekulskega sidranja, medtem ko bomo proste energije in ustrezne vezavne afinitete med odkritimi proteinskimi tarčami in polifenolnimi ligandi temeljito preučili s simulacijami molekulske dinamike. Končni cilj predlaganega projekta je najti najmočnejše polifenole ali njihove mešanice, ki bi lahko po naknadni optimizaciji služili kot funkcionalna prehranska ali krmna dopolnila z visokim antioksidativnim, antikarcinogenim in antimikrobnim delovanjem. Poleg tega bomo s kombiniranimi eksperimentalnimi in teoretičnimi študijami raziskali intrigantne molekularne mehanizme, ki narekujejo antioksidativne, antikarcinogene in antimikrobne lastnosti preiskovanih polifenolov. Njihovo razumevanje bo prvič razkrilo globlje povezave med strukturo in biološkimi aktivnostmi znotraj in med različnimi vrstami polifenolov.

Projekt je razdeljen na štiri delovne pakete (DP):

DP1 - Ekstrakcija, izolacija in kemijska karakterizacija

Posamezne hmeljne ekstrakte z uporabo CO2 smo ustrezno alikvotirali, ter shranili za nadaljnjo uporabo v naslednjih delovnih sklopih predlaganega projekta. Pripravili smo tudi ekstrakte, kjer smo kot topilo uporabili superkritični CO2 z dodatkom etanola (5% in 10 %).
Izvedli smo tudi čiščenje ksantohumola iz ekstraktov hmelja z metodo preparativnega HPLC. V ta namen, smo ekstrakte hmelja najprej analizirali s tankoplastno kromatografijo (TLC), na podlagi katere smo izvedli 4 zaporedne ločbe na preparativnem HPLC. Tako smo pridobili 43,29 mg ksantohumola v čisti obliki. Prvo ločbo smo naredili s kromatografsko kolono PuriFlash (C16 - stacionarna faza), da smo odstranili nečistoče iz ekstrakta. Nadaljnje 3 ločbe smo naredili na koloni FP-50C18HP-0025 (C18 - stacionarna faza). Kot mobilno fazo pri HPLC smo uporabili kombinacije vode in acetonitrila (oba z dodatkom 0,1 % mravljične kisline).
Dosegli smo visoko čistost ksantohumola, ki je bila višja od 90 % (določeno s HPLC).

DP2 - Raziskava oksidativne aktivnosti

Naloga 1 - Eksperimentalna študija: Spektrofotometrične (DPPH in ABTS analiza) in elektrokemijske (ciklična voltametrija in diferencialna pulzna voltametrija) metode

Opravili smo test DPPH. Metoda lovljenja prostega radikala DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) je hitra in enostavna za izvedbo. Osnovni princip metode je oksidativni razpad spojin v ekstraktih hmelja. Z UV/VIS metodologijo pri valovni dolžini 515 nm smo izmerili absorbanco, ki je bila premosorazmerna z antioksidativnim potencialom hmelja. Rezultate smo prikazali kot vrednost IC50. Le-ta predstavlja koncentracijo fenolnih komponent, ki so potrebne za zmanjšanje absorbance za 50%. Tako smo pomerili ekstrakte hmelja in določili vrednosti za antioksidativni potencial z IC50 od 0,005 do 0,01 mg/mL.

Naloga 2 - Računalniška študija: Metodologija QM-ORSA

Osnovni molekularni mehanizmi so bili v primeru elagične kisline, prikazani s pomočjo testa za določitev celotne antioksidativne aktivnosti, ter zasnovani na kvantno mehanskih izračunih. Z radikalom HO je elagična kislina izkazovala mehanizma prenosa vodikovega atoma in tvorbe radikalskega adukta, medtem, ko je mehanizem zaporednega prenosa elektronov z izgubo protona odgovoren za odstranjevanje radikala CCl3OO. Izračunani konstanti reakcijske hitrosti z obema prostima radikaloma se odlično ujemata z eksperimentalnimi vrednostmi. Preučili smo tudi antioksidativno delovanje ksantohumola v primerjavi s spojino troloks.

DP3 - Raziskava antikarcinogenih aktivnosti

Naloga 1 - Eksperimentalna študija: Gelska elektroforeza (komet) in gamma-H2AX test

Naloga 2 - Računalniška študija: Inverzno molekulsko sidranje in molekulska dinamika

Za določitev najverjetnejših molekulskih mehanizmov kvercetina, ter njegovih metablitov, na onkogene signalne poti, smo uporabili inverzno molekulsko sidranje. Polifenolne spojine smo sidrali v aktivna mesta vseh razpoložljivih struktur človeških proteinov iz baze podatkov Protein Data Base (PDB) (~42 000 proteinov) z uporabo lastno razvitega algoritma CANDOCK. Tako smo identificirali človeške protein, ki so potecijalne tarče, in pri katerih je ocenjena ugodna vezava z izbrano spojino.

Naloga 3 - Računalniška študija: Kvantno-mehanski pristop/Razvoj testa za določitev antikarcinogene aktivnosti, zasnovan na kvantno-mehanskih izračunih (protokol QMOCA)

Dodaten cilj projekta je razvoj kvantno-mehanskega testa (protocol QMOCA) za celotno antikarcinogeno delovanje, ki je navdihnjen po protokolu QM-ORSA. Pri izvedbi testa smo se osredotočili na kinetično raziskavo reakcij med polifenoli, potencialnimi antikarcinogenimi učinkovinami in rakotvornimi snovmi. Za pripravo modela, ki bi bil primeren za računanje antikarcinogenega potenciala s pomočjo QMOCA smo simulirali reakcije med gvaninom in kemijskimi karcinogeni: aflatoksin B1 (AFB1) exo-8,9-epoksid, etilen oksid, propilen oksid, kloretilen oksid, vinilkarbamat epoksid, glicidamid, 2-cianoetilen oksid, stiren oksid ter ?-propiolakton. V ta namen je uporabljeno 14 različnih metod, ki se uporabljajo za študije termokemije, kemijske kinetike in nekovalentnih interakcij, in sicer: M05-2X, M06-2X, M06-HF, M08-HX, M11, M11-L, MN12-SX, MN12-L, MN15, MN15-L, N12, N12-SX, B3LYP-D3, wB97XD.

DP4 - Raziskava antimikrobne aktivnosti

Naloga 1 - Eksperimentalna študija: Določitev MIC in MBC vrednosti

Naloga 2 - Računalniška študija: Inverzno molekulsko sidranje in molekulska dinamika

Bibliografija: Dr. Jelena Tošović [52709]