Antioksidativni, antimikrobni in antikancerogeni potencial hmeljnih ekstraktov
Antioxidative, antimicrobial and anticarcinogenic potential of hop extracts
Vodja projekta: dr. Zala Kolenc
Osnovni podatki o raziskovalnem projektu
Šifra operacije | OP20.04331 |
Naslov projekta | Antioksidativni, antimikrobni in antikancerogeni potencial hmeljnih ekstraktov (Antioxidative, antimicrobial and anticarcinogenic potential of hop extracts) |
Vodja projekta | 35430 Dr. Zala Kolenc |
Vrsta operacije |
Javni razpis za spodbujanje raziskovalcev na začetku kariere 2.1 |
Obdobje financiranja projekta |
1.4.2019-31.3.2022 |
Programska skupina, v kateri je raziskovalec zaposlen in raziskovalna ustanova |
Separacijski procesi in produktna tehnika, prof.dr. Željko Knez, P2-0046, 794 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo |
Gospodarski subjekt, ki sodeluje v raziskovalnem projektu |
Tanin Sevnica kemična industrija d.d. |
Vsebinski opis projekta
Hmeljni storžki so tisti del rastline hmelja, ki se uporablja v nadaljnji predelavi, predvsem v pivovarstvu. Hmeljni storžki vsebujejo snovi, ki pivu dajejo okus, vonj in stabilnost.
Najpomembnejše sestavine hmeljnega storžka so hmeljne smole, eterično olje in polifenoli.
-Hmeljne smole (nosilec grenkega okusa v pivu) delimo na mehke in trde, mehke pa naprej na α- in β-frakcijo. Glede na to, da imajo te spojine lastnosti kislin, jih imenujemo
α- in β-kisline. α-kisline so sestavljene iz petih sorodnih spojin, med katerimi je največ humulona, kohumulona in adhumulona. β-kisline pa kot najpomembnejši predstavniki
sestavljajo lupulon, kolupulon ter adlupulon.
-Eterično olje izkazuje za večino rastlin značilen vonj, ki ga povzročajo hlapne snovi. Te lahko izoliramo z destilacijo z vodno paro in pri tem dobimo oljnato tekočino, ki jo imenujemo
eterično olje. Hmelj ga vsebuje približno en odstotek. Eterično olje hmelja je sestavljeno iz več 100 spojin, pa vendar lahko poudarimo najpomembnejše, kot so mircen, humulen ter kariofilen,
ki skupaj predstavljajo kar 90 odstotkov vsega eteričnega olja.
-Fenoli so rastlinski sekundarni metaboliti, ki so ene najbolj pogostih snovi v rastlinah. Večina fenolnih spojin ima dve ali več hidroksilnih skupin in so podvržene konjugacijam. Ponavadi
so fenoli topni v polarnih organskih topilih. Suhi storžki hmelja vsebujejo 4 - 14 % fenolnih spojih. Njihova vsebnosti pase zelo razlikuje med kultivarji, ki so aromatični in tistimi ki so
visoko grenčični. Med fenolnimi spojinami so v hmelju najbolj zastopani prenilflavonoidi, katerih glavni predstavnik je ksantohumol.
Glavni cilji projekta so na področje ekstrakcije hmelja uvesti moderne ekstrakcijske tehnike pridobiti ekstrakte s čimvečjim antioksidativnim, antimikrobnim ter antikarcinogenim potencialom .
Projekt je zasnovan tako z laboratorijskimi eksperimentalnimi poskusi, kot tudi s teoretičnimi računalniškimi simulacijami. V osnovi je projekt razdeljen na 5 delovnih sklopov (DS):
DS1. Moderne tehnike za ekstrakcijo hmelja
Izvedli smo ekstrakcije s superkritičnim CO2 za ekstrakcijo hmelja, prav tako tudi ekstrakcijo z mikrovalovi. Ekstrakcija s samim CO2 ni omogočala visokih izkoritkov reakcije, medtem ko je dodatek
organskih sotopil in vode omogočal višje izkoristke. Ekstrakcija s superkritičnim CO2 s sotopili sicer kaže potencial predvsem na področju specifičnosti ekstrakcije.
Prav tako smo, za določanje antikacerogenega, antimikrobnega ter antioksidativnega potenciala, izvedli tudi čiščenje spojine ksantohumola iz ekstraktov hmelja s preparativnim HPLC.
Prvo ločbo smo naredili s PuriFlash (C16) kolono - stacionarna faza, da smo odstranili večje nečistoče iz ekstrakta, nadaljnje 3 ločbe pa smo naredili na koloni FP-50C18HP-0025 (C18) - stacionarna faza.
Potek izolacije čiste spojine ksantohumola smo spremljali s tankoplastno kromatografijo kot tudi z metodo HPLC. Tako pripravljeno spojino s čistostjo več kot 97 % smo uporabili v nadaljnjih delovnih
sklopih.
DS2. Kemijska karakterizacija hmeljnih ekstraktov
Za karakterizacijo ekstraktov hmelja, kot tudi za določanje čistosti izoliranega ksantohumola, smo uporabljali metodo HPLC. Pri kemijski karakterizaciji smo se osredotočali predvsem na določanje pomembnejših komponent in sicer α-kislin (kohumulon, humulon, adhumulon), β-kislin (kolupulon, lupulon, adlupulon), ter ksantohumola.
DS3. Določanje antioksidativnega potenciala hmeljnih ekstraktov
Za določanje antioksidativnega potenciala smo uporabili modernejšo metodo ORAC, s katero merimo oksidativni razpad molekule fluoresceina, ki ji dodamo AAPH (2,2'-Azobis(2-methilpropionamidin) dihidroklorid), le-ta služi kot vir radikalov. Primerjalno smo opravili tudi eksperimentalno študijo antioksidativnega potenciala z metodo FRAP ter DPPH. Primerjalno glede na kemijsko karakterizacijo hmeljnih ekstraktov smo lahko določili da visok antioskidativni potencial v veliki meri prispeva ksantohumol. Kar smo potrdili tudi s primerjalno študijo določanja antioskidativnega potenciala izolirani čisti spojini ksantohumola. Eksperimentalne študije smo nadgradili tudi z računalniškimi kvantno mehanskimi izračuni. Poleg tega smo izvedli primerjalno študijo antioksidativnega potenciala ksantohumola ter izoksantohumola. Njuna kemijska sestava se razlikuje glede na število hidroksilnih skupin, zaradi česar smo predvidevali tudi razliko v antioksidativnem potencialu. Tako smo z metodo ORAC določili 1,95-krat večji, z metodo FRAP pa 3,41-krat večji antioskidativni potencial ksantohumola v primerjavi z izoksantohumolom.
DS4. Določanje antimikrobnega potenciala hmeljnih ekstraktov
Ekstraktom hmelja, ki smo jih pridobili tekom projekta z modernimi tehnikami ekstrakcije, smo določili vrednosti minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) ter minimalne baktericidne koncentracije (MBC). Antimikrobni potencial ekstraktov hmelja, kot tudi čiste spojine ksantohumola smo testirali na več bakterijah: Listeria monocytogenes (G+), Salmonella typhumurium (G-), Bacillus cereus (G+), Staphylococcus aureus (G+), Pseudomonas aeruginosa (G-) in Escherichia coli (G-). Največjo protimikrobno aktivnost so ekstrakti hmelja izkazali proti bakteriji Staphylococcus aureus. Poleg posameznih ekstraktov hmelja in testiranje čistega ksantohumola, smo testirali tudi hmeljev prečiščen ekstrakt β-kislin, ter hmeljev ekstrakt z povečanim deležem α- in β- kislin. Dobljene vrednosti MIC ter MBC pa nakazujejo, da β-kisline v največji meri prispevajo k antimikrobnemu delovanju hmeljnih ekstraktov. Preučevali smo tudi vpliv gostote medija na vrednosti MIC posameznih hmeljnih ekstraktov ter ob tem računali/določili tudi mikrobno kinetiko.
DS5. Določanje antikancerogenega potenciala hmeljnih ekstraktov
Izvedli smo kvatno-mehansko študijo reakcije ksantohumola (ter njegovih presnovnih metabolitov: izoksantohumola, 8-prenilnaringenina, 6-prenilnaringenina), kjer smo izračunali proste aktivacijske energije
s končnim karcinogenom aflatoksina B1. Dokazali smo, da je prosta aktivacijska energija med AFB1 in ksantohumolom (ali njegovimi presnovnimi metaboliti) nižja od proste aktivacijske energije med AFB1
in gvaninom. Izsledke računalniške študije smo objavili skupaj z eksperimentalnimi podatki, kjer smo z metodo ˝Commet assay˝ dokazali zaščitni učinek ksantohumola (in njegovih presnovnih metabolitov)
na celicah HepG2 pred karcinogenom AFB1.
Izvedli smo tudi inverzno molekulsko sidranje za molekulo ksantohumola (ter njegovih presnovnih metabolitov). Začetno strukturo ksantohumola smo uporabili iz baze ZINC ter jo optimizirali s programom
Proteus. Tarče, v katere smo sidrali ksantohumol (ali njegove presnovne metabolite) so v in silico eksperimentu predstavljali ustrezno pripravljeni človeški proteini iz baze Protein Data Bank.
Določili smo več človeških proteinov z vezavno energijo nizke vrednosti, ki jih lahko povežemo v metabolne mehanizme karcenogeneze.
Bibliografija: Dr. Zala Kolenc [35430]